miércoles, 4 de mayo de 2011

Diagnóstico genético mediante secuenciación de ADN

Dr. Javier García Planells
Instituto de Medicina Genómica
Parque Científico de la Universidad de Valencia

Dr. Manuel Pérez-Alonso
Departamento de Genética
Universidad de Valencia


Algunos lectores de este blog nos han pedido que escribamos una breve revisión acerca de las aplicaciones de las técnicas de secuenciación de ADN en el diagnóstico genético de enfermedades. Este artículo trata, en particular, sobre la utilidad diagnóstica de las nuevas técnicas de secuenciación masiva del ADN, también conocidas como ultrasecuenciación, o bien Next Generation Sequencing (NGS), en comparacion con las técnicas basadas en el método de Sanger.

El diagnóstico genético molecular de enfermedades se ha convertido en una técnica que se emplea cada vez más en la Medicina. Entre las diferentes técnicas de análisis de ADN, la secuenciación se considera como la técnica de referencia, dada su alta sensibilidad y especificidad. La importancia creciente que tiene la secuenciación de ADN en el diagnóstico ha provocado un gran desarrollo en todo los aspectos relacionados con las tecnologías de secuenciación de ADN, así como en las herramientas informáticas para el procesado y análisis de las secuencias de ADN.

Entre las nuevas técnicas de secuenciación de ADN que se han desarrollado en los últimos años destacan las técnicas de nueva generación, que se suelen conocer como Next Generation Sequencing, o simplemente NGS. Cabe preguntarse, por tanto cuál es la relevancia de la secuenciación del tipo NGS en el diagnóstico y cual es la técnica de referencia que se utiliza hoy en dia para el diagnóstico de enfermedades genéticas. ¿Se utilizan ya las nuevas técnicas de secuenciación de ADN del tipo NGS? ¿O se utilizan todavía las ténicas "clásicas" de secuenciación de ADN?

En otras palabras, ¿qué metodo de secuenciación de ADN se considera hoy en dia como el método de referencia para el diagnóstico genético de enfermedades? La respuesta a esta pregunta es muy directa. El método de referencia para la secuenciación de ADN para su uso en el diagnóstico genético de enfermedades sigue siendo el método de Sanger, en combinación con la electroforesis capilar. El método de Sanger, que es considerado como la "técnica clásica" de secuenciación es el único que, por el momento, aparece en las directrices y estándares de calidad (Best Practice Guidelines) de los organismos internacionales que se encargan de supervisar el buen hacer de los laboratorios de diagnóstico genético.

¿Son de aplicación para el diagnóstico las nuevas técnicas de secuención de ADN, conocidas como secuenciación masiva del ADN, ultrasecuenciación, o bien Next Generation Sequencing (NGS)? La utilidad de estas técnicas para el diagnóstico genético es, por el momento, muy limitada. Estas nuevas técnicas están todavía en fase de desarrollo y pendientes de ser validadas.

Es de esperar que, durante los próximos años, se llegue a una validación de los nuevos sistemas de secuenciación para su uso en el diagnóstico genético de enfermedades. Sin embargo, por el momento, las técnica de Sanger seguirá siendo, durante varios años más, el método de referencia para la secuenciación de ADN de uso en el diagnóstico genético.

Existen muy pocos precedentes en los que una muestra de ADN de un paciente se haya analizado mediante la secuenciación de su genoma, utilizando alguna de las nuevas técnicas que hemos mencionado. Un ejemplo reciente de un caso clínico que ha sido resuelto con las nuevas técnicas de secuenciación genómica es el caso de un niño llamado Nicholas Volker, que sufría una enfermedad genética rara.

Tras un largo recorrido por las consultas médicas de numerosos médicos y sin conseguir un diagnóstico certero, se optó por analizar el genoma completo de ese niño, utilizando las nuevas técnicas de secuenciación de ADN. El resultado de este estudio ha sido publicado en la revista científica Genetics in Medicine, y también ha tenido un gran impacto en los medios de comunicación. Los artículos periodísticos publicados en el diario EL PAÍS acerca de este caso clínico son:

EE UU usa por primera vez esta técnica para evitar la muerte de un enfermo
DAVID ALANDETE - (Washington, 08/01/2011)

JAVIER SAMPEDRO (08/01/2011)

Como referencia, para quienes quieran profundizar en los métodos utilizados, los artículos científicos donde se describe este interesante caso clínico son estos:

Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, Helbling D, Bonacci BB, Decker B, Serpe JM, Dasu T, Tschannen MR, Veith RL, Basehore MJ, Broeckel U, Tomita-Mitchell A, Arca MJ, Casper JT, Margolis DA, Bick DP, Hessner MJ, Routes JM, Verbsky JW, Jacob HJ, Dimmock DP.
Genet Med. 2011 Mar;13(3):255-62.
PMID:21173700

Mayer AN, Dimmock DP, Arca MJ, Bick DP, Verbsky JW, Worthey EA, Jacob HJ, Margolis DA.
Genet Med. 2011 Mar;13(3):195-6.
PMID:21169843

Consideramos importante destacar que un caso clínico como el de pequeño Nicholas Volker, aunque se ha resuelto de manera satisfactoria mediante estas nuevas técnicas de secuenciación de ADN, en un caso excepcional entre los pocos casos de pacientes cuyo genoma completo (o casi completo) ha sido analizado.

En cualquier caso un estudio como este ha sido planteado como un Proyecto de Investigación, y no como un caso sometido a un diagnóstico genético rutinario. Además de las limitaciones que tienen las nuevas técnicas de secuenciación del tipo NGS en cuanto a su validez como prueba de utilidad clínica, una aspecto importante el el coste de las mismas. El análisis de ADN para el caso del pequeño Nicholas tuvo un coste de 154.000 euros, un coste totalmente inasumible como rutina diagnóstica en ningún país desarrollado.

Tras la publicación en los medios de un caso como este ha generado un debate acerca de la aplicabilidad de las nuevas técnicas de secuenciación para el diagnóstico genético de enfermedades. En el siguiente enlace puede seguirse esta interesante discusión, que tiene aspectos científicos y aspectos sociales:

(Technology Review,  published by MIT)



4 comentarios:

Alberto Acedo dijo...

Alberto Acedo
Promotor Técnico proyecto AC-Gen
Splicing & Cancer (CSIC)
ac.gen.rl@gmail.com

Estimado Dr Javier García,
Muchas gracias por su análisis. Estoy de acuerdo con usted en que hoy en día en el diagnóstico genético molecular de enfermedades el principal método de referencia en secuenciación es el Sanger de electroforesis capilar, como bien indica abalado por estándares de calidad.
Sin embargo soy de la opinión de que la secuenciación masiva será el futuro inmediato del diagnóstico genético y no va a hacer falta muchos años para verlo.
La secuenciación masiva no es una tecnología tan reciente:
el artículo : Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors se publica en Nature el 31 de julio de 2005 (Nature 437, 376-380 (15 September 2005) | doi:10.1038/nature03959; Received 6 May 2005; Accepted 10 June 2005; Published online 31 July 2005).
http://www.nature.com/nature/journal/v437/n7057/full/nature03959.html
En 2008 ya se estaba analizando la relevancia de la tecnología: The development and impact of 454 sequencing (Nature Biotechnology 26, 1117 - 1124 (2008)
Published online: 9 October 2008 | doi:10.1038/nbt1485). http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n10/full/nbt1485.html
Por otro lado, existen al menos 3 empresas que comercializan diferentes tipos de secuenciadores cada uno con una tecnología de secuenciación que lo difiere del resto, con sus diferentes ventajas e inconvenientes para que tipo de estudio a realizar. Este abanico de posibilidades implica una profunda reflexión de características de cada secuenciador, sobre todo si lo que se pretende es realizar un análisis genético para procurar un diagnóstico molecular, puesto que la elección puede llegar a ser un problema.
La mayoría de los secuenciadores de NGS fueron desarrollados para secuenciar genomas. Diversos proyectos como el del los 1000 Genomas o premios como xprize genomics (http://genomics.xprize.org/ ) es lo que potencian con fines de investigación, aunque siempre vayan unidos a la coletilla “futura aplicación para el diagnóstico”
A su vez el estudio de exómas para el diagnóstico de enfermedades raras como en el caso de Nicholas Volker también se relacionan con el amito de la investigación.

Entonces, como usted menciona los dos problemas básicos en la aplicación de NGS en el diagnóstico genético, por orden serían:
- Validación de las tecnología (puesto que existen varias)
- Coste de la tecnología
Yo además añadiría otros dos:
- tiempo necesario para obtener resultados
- carga bioinformática (diferencias de algoritmos) que afectan al resultado final

Opino, y parece ser que diferentes grupos, están en la línea, que estos “problemas” pueden solventarse aplicando un enfoque diferente:
Reduciendo o concretando las regiones que nos interese secuenciar.

No podemos, de momento, pasar de secuenciar de 1 a 4 genes para un diagnóstico de una enfermedad concreta a todo el genoma, puesto que no es rentable por los criterios mencionados. El análisis dirigido a la enfermedad en cuestión (siempre y cuando sea posible) sigue siendo fundamental para la práctica clínica y en este caso será clave para la implantación de NGS en la práctica clínica.
El resto, de momento, seguirá siendo investigación.

Javier García Planells dijo...

Estimado Dr. Alberto Acedo,
Estoy completamente de acuerdo con todos sus comentarios.
La intención del comentario original es explicar, de una manera breve, sencilla y dirigida a personas no especializadas en este campo, las aplicaciones actuales de las técnicas de secuenciación en el diagnóstico de enfermedades, comparando las nuevas tecnologías de secuenciación frente a la secuenciación tradicional de Sanger. La preocupación que originó este comentario estaba relacionada con la gran cantidad de información que recibimos de manera constante de como las tecnologías de ultrasecuenciación van a revolucionar la Medicina hasta el punto de que podemos encontrar ofertas diagnósticas aplicando estas tecnologías, lo cual puede llegar a confundir, incluso a profesionales de la Medicina, que evidentemente no tienen un conocimiento profundo en este campo. Hoy por hoy, desde un punto de vista diagnóstico, la secuenciación de Sanger es la tecnología 'gold standard' y la única validada. Existe una máxima en calidad para la aplicación de las nuevas tecnologías que indica que una tecnología en uso no puede ser sustituida por otra nueva siempre y cuando no aporte, al menos, la misma sensibilidad o una relación coste/eficacia muy significativa. Evidentemente, en estos momentos, las aplicaciones de ultrasecuenciación están todavía lejos de cumplir cualquiera de los dos supuestos.
Evidentemente esto es cuestión de tiempo y efectivamente, no hablamos de mucho tiempo.
Además, a parte de las cuestiones técnicas, de coste y de tiempo, debemos tener en cuenta otros aspectos muy importantes y que todavía no se han puesto encima de la mesa, los aspectos éticos y legales. Tanto los temas diagnósticos, como los de investigación, estan regulados por una ley reciente, la LIB 14/2007 que deberemos hacer cumplir, en aspectos tan básicos como el de la información al paciente, la idoneidad de las pruebas genéticas y el derecho a conocer y a no conocer.
Efectivamente la secuenciación dirigida puede proporcionarnos un puente para andar el camino con las suficientes garantías.

lorena dijo...

Estoy cursando el curso postgrado de Genética Médica y el otro día en la presentación de Diagnóstico Molecular al explicarnos las nuevas técnicas de ultrasecuenciación pensaba que ya estaban en uso, y que la técnica "clásica" (Sanger) ya no se utilizaba.

Dentro del temario de Ingeniería Genética entraba el método Sanger y fue así como conocí esta técnica, la cual me pareció muy original, aunque si...demasiado lenta para poder tener un diagnóstico completo del genoma.

Espero que dentro de unos años podáis publicar, YA SOLO SE UTILIZAN LAS NUEVAS TÉCNICAS DE ULTRASECUENCIACIÓN,ya que con estas nuevas técnicas seguro que las investigaciones de relacionar un gen con una enfermedad se podrá hacer con una mayor rapidez, y así podremos avanzar mucho más en este campo.

Un saludo.

Anónimo dijo...

Hola soy la Dra Patricia Díaz Gimeno colaboradora en el blog de Medicina Genómica en una ocasión:-)

Nosotros, en el departamento de Bioinformática y Genómica liderado por el Dr Joaquín Dopazo, estamos trabajando para que las NGS se puedan analizar e interpretar de forma sencilla y automatizada, así como nos encontramos investigando para asociar variantes génicas a enfermedades. No obstante, la aplicación clínica aún llevará tiempo, del mismo modo que han hecho falta unos cuantos años para que la tecnología de microarrays se pudiera aplicar de manera diagnóstica. De la investiagación a la traslación clínica y diagnóstica suele haber un largo proceso.

No cabe duda que las NGS son un futuro próximo y revolucionario de aplicación clínica!

Medical Genetics News

Genetics Home Reference (NIH)

Human Genome Research Institute (NIH)

Genetics News (Medical News Today)

Diagnóstico genético de enfermedades: preguntas y respuestas

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