miércoles, 4 de mayo de 2011

Diagnóstico genético mediante secuenciación de ADN

Dr. Javier García Planells
Instituto de Medicina Genómica
Parque Científico de la Universidad de Valencia

Dr. Manuel Pérez-Alonso
Departamento de Genética
Universidad de Valencia


Algunos lectores de este blog nos han pedido que escribamos una breve revisión acerca de las aplicaciones de las técnicas de secuenciación de ADN en el diagnóstico genético de enfermedades. Este artículo trata, en particular, sobre la utilidad diagnóstica de las nuevas técnicas de secuenciación masiva del ADN, también conocidas como ultrasecuenciación, o bien Next Generation Sequencing (NGS), en comparacion con las técnicas basadas en el método de Sanger.

El diagnóstico genético molecular de enfermedades se ha convertido en una técnica que se emplea cada vez más en la Medicina. Entre las diferentes técnicas de análisis de ADN, la secuenciación se considera como la técnica de referencia, dada su alta sensibilidad y especificidad. La importancia creciente que tiene la secuenciación de ADN en el diagnóstico ha provocado un gran desarrollo en todo los aspectos relacionados con las tecnologías de secuenciación de ADN, así como en las herramientas informáticas para el procesado y análisis de las secuencias de ADN.

Entre las nuevas técnicas de secuenciación de ADN que se han desarrollado en los últimos años destacan las técnicas de nueva generación, que se suelen conocer como Next Generation Sequencing, o simplemente NGS. Cabe preguntarse, por tanto cuál es la relevancia de la secuenciación del tipo NGS en el diagnóstico y cual es la técnica de referencia que se utiliza hoy en dia para el diagnóstico de enfermedades genéticas. ¿Se utilizan ya las nuevas técnicas de secuenciación de ADN del tipo NGS? ¿O se utilizan todavía las ténicas "clásicas" de secuenciación de ADN?

En otras palabras, ¿qué metodo de secuenciación de ADN se considera hoy en dia como el método de referencia para el diagnóstico genético de enfermedades? La respuesta a esta pregunta es muy directa. El método de referencia para la secuenciación de ADN para su uso en el diagnóstico genético de enfermedades sigue siendo el método de Sanger, en combinación con la electroforesis capilar. El método de Sanger, que es considerado como la "técnica clásica" de secuenciación es el único que, por el momento, aparece en las directrices y estándares de calidad (Best Practice Guidelines) de los organismos internacionales que se encargan de supervisar el buen hacer de los laboratorios de diagnóstico genético.

¿Son de aplicación para el diagnóstico las nuevas técnicas de secuención de ADN, conocidas como secuenciación masiva del ADN, ultrasecuenciación, o bien Next Generation Sequencing (NGS)? La utilidad de estas técnicas para el diagnóstico genético es, por el momento, muy limitada. Estas nuevas técnicas están todavía en fase de desarrollo y pendientes de ser validadas.

Es de esperar que, durante los próximos años, se llegue a una validación de los nuevos sistemas de secuenciación para su uso en el diagnóstico genético de enfermedades. Sin embargo, por el momento, las técnica de Sanger seguirá siendo, durante varios años más, el método de referencia para la secuenciación de ADN de uso en el diagnóstico genético.

Existen muy pocos precedentes en los que una muestra de ADN de un paciente se haya analizado mediante la secuenciación de su genoma, utilizando alguna de las nuevas técnicas que hemos mencionado. Un ejemplo reciente de un caso clínico que ha sido resuelto con las nuevas técnicas de secuenciación genómica es el caso de un niño llamado Nicholas Volker, que sufría una enfermedad genética rara.

Tras un largo recorrido por las consultas médicas de numerosos médicos y sin conseguir un diagnóstico certero, se optó por analizar el genoma completo de ese niño, utilizando las nuevas técnicas de secuenciación de ADN. El resultado de este estudio ha sido publicado en la revista científica Genetics in Medicine, y también ha tenido un gran impacto en los medios de comunicación. Los artículos periodísticos publicados en el diario EL PAÍS acerca de este caso clínico son:

EE UU usa por primera vez esta técnica para evitar la muerte de un enfermo
DAVID ALANDETE - (Washington, 08/01/2011)

JAVIER SAMPEDRO (08/01/2011)

Como referencia, para quienes quieran profundizar en los métodos utilizados, los artículos científicos donde se describe este interesante caso clínico son estos:

Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, Helbling D, Bonacci BB, Decker B, Serpe JM, Dasu T, Tschannen MR, Veith RL, Basehore MJ, Broeckel U, Tomita-Mitchell A, Arca MJ, Casper JT, Margolis DA, Bick DP, Hessner MJ, Routes JM, Verbsky JW, Jacob HJ, Dimmock DP.
Genet Med. 2011 Mar;13(3):255-62.
PMID:21173700

Mayer AN, Dimmock DP, Arca MJ, Bick DP, Verbsky JW, Worthey EA, Jacob HJ, Margolis DA.
Genet Med. 2011 Mar;13(3):195-6.
PMID:21169843

Consideramos importante destacar que un caso clínico como el de pequeño Nicholas Volker, aunque se ha resuelto de manera satisfactoria mediante estas nuevas técnicas de secuenciación de ADN, en un caso excepcional entre los pocos casos de pacientes cuyo genoma completo (o casi completo) ha sido analizado.

En cualquier caso un estudio como este ha sido planteado como un Proyecto de Investigación, y no como un caso sometido a un diagnóstico genético rutinario. Además de las limitaciones que tienen las nuevas técnicas de secuenciación del tipo NGS en cuanto a su validez como prueba de utilidad clínica, una aspecto importante el el coste de las mismas. El análisis de ADN para el caso del pequeño Nicholas tuvo un coste de 154.000 euros, un coste totalmente inasumible como rutina diagnóstica en ningún país desarrollado.

Tras la publicación en los medios de un caso como este ha generado un debate acerca de la aplicabilidad de las nuevas técnicas de secuenciación para el diagnóstico genético de enfermedades. En el siguiente enlace puede seguirse esta interesante discusión, que tiene aspectos científicos y aspectos sociales:

(Technology Review,  published by MIT)



martes, 3 de mayo de 2011

Fallo ovárico prematuro y su relación con el gen FMR1

Dr. Rafael Sánchez-Usabiaga
ClinicaFertil
México

La insuficiencia ovárica prematura afecta al 1% de las mujeres menores de 40 años. Se ha observado que entre el 4 y el 31% de las  pacientes que presentan insuficiencia ovárica prematura, muestran agregación familiar (Shuettler et al, 2011). Las etiologías del fallo ovárico prematuro (POF) son diversas y en muchas ocasiones idiopáticas. La causa identificable más común se relaciona con rangos anormales de repetidos CGG en  el microsatélite del gen FMR1 (Rohr et al 2008).
Las proteínas generadas por el gen FMR1 (FMRP) se localizan en citoplasma; las variantes excluyentes del exon 14, son de localización nuclear. Estas proteínas presentan dominios KH, los cuales les permiten unirse al RNAm y regular la elongación. Los dominios KH2 se unen a una estructura secundaria del RNA  formada por 2 asas, conocida como “kissing complex”. Esto permite regular la expresión. La proteína FMRP es un regulador y marca el momento de salida del núcleo de alrededor de 400 RNAs. También es capaz de regular la expresión de muchos mensajeros, incluyendo a los que la generan. En el cerebro fetal se estima que 4% de los mensajeros son regulados por FMR1. Las espermatogonias requieren esta regulación para una proliferación óptima (OMIM*309550). La expresión de FMR1 también está involucrada en la maduración de los ovocitos (Gleicher et al, 2011).
Los mecanismos por los cuales se regula el gen FMR1 aún se encuentran en estudio. Las repeticiones CGG en el exon 1 ha tomado un papel especial, ya que su variabilidad modifica la expresión del gen (Chen et al, 2003). El número de repeticiones que predomina en la población es de 30 (Fu et al, 1991) y se ha observado que cada 5 repeticiones por arriba de esta cifra disminuye la cantidad de proteína FMRP, sin disminuir el número de transcritos (Shuettler et al, 2011; Gleicher et al, 2010). Los repeticiones menores a 26  aumentan la cantidad de FMRP (Shuettler et al, 2011).
FMRP regula la velocidad de reclutamiento de folículos. Las pacientes que presentan de 26 a 34 repeticiones se consideran normales, con una velocidad de reclutamiento mayor pero con un periodo de fertilidad que declina a los 35 años; las pacientes con mayor cantidad de repeticiones reclutan menos folículos, presentan niveles menores de hormona antimulleriana (AMH) pero hasta un 10% se embaraza con el diagnóstico de POF. Estos cambios permiten a la población tener mujeres con capacidad reproductiva en diferentes edades y podría explicar su alta incidencia en la población (Gleicher et al, 2010; 2011).
Para terminar este artículo, presentamos tres enlaces recomendados y tres referencias a artículos científicos.

Enlaces de interés:
FMR1-Related Disorders (GeneReviews)
Tres artículos científicos de revisión sobre este tema:

Defining ovarian reserve to better understand ovarian aging
Gleicher N, Weghofer A, Barad DH.
Reprod Biol Endocrinol. 2011 Feb 7;9:23.
PMID:21299886
FMR1 genotype with autoimmunity-associated polycystic ovary-like phenotype and decreased pregnancy chance
Gleicher N, Weghofer A, Lee IH, Barad DH.
PLoS One. 2010 Dec 16;5(12):e15303.
PMID: 21179569
Can the FMR1 gene predict early ovarian aging?
Gleicher N, Barad DH.
Womens Health (Lond Engl). 2010 Mar;6(2):165-9.
PMID:20187721

¿Qué es el Diagnóstico Genético Preimplantacional?

Dr. Carles Giménez
Director Científico
Reprogenetics Spain, S.A.
C/Tuset, 23, 6è 1ª
08006 Barcelona

El Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) es una innovadora técnica de detección de anomalías genéticas previa a la transferencia del embrión al útero de la mujer.
Se trata de una metodología que precisa realizarse en el marco de un ciclo de fecundación in vitro (FIV), y que utiliza técnicas de micromanipulación embrionaria (biopsia) junto con técnicas de genética molecular que permiten el diagnóstico de anomalías genéticas en el embrión.
El DGP está indicado en personas portadoras de enfermedades monogénicas, translocaciones, inversiones u otras anomalías cromosómicas. Estas características pueden evitar la implantación de los embriones, provocar la pérdida del embarazo, o el nacimiento de un recién nacido con problemas físicos y/o retraso mental o afecto de una enfermedad genética.
Así mismo, el DGP se recomienda en pacientes infértiles con historia previa de abortos espontáneos de repetición (RAB) y otros pacientes estériles o infértiles con fallos repetidos de implantación (RIF), edad materna avanzada (AMA) o factor masculino (FMASC) que se encuentran en un ciclo de FIV.
El DGP puede ayudar a prevenir estos resultados adversos identificando los embriones afectos durante su desarrollo en el laboratorio y antes de ser transferidos en un ciclo de FIV.
En el siguiente enlace, podéis encontrar información relacionada con este campo:

Medical Genetics News

Genetics Home Reference (NIH)

Human Genome Research Institute (NIH)

Genetics News (Medical News Today)

Diagnóstico genético de enfermedades: preguntas y respuestas

Diagnóstico genético de enfermedades: preguntas y respuestas
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